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Expression and characterization of calreticulin gene isolated from Rhipicephalus annulatus after Babesia bigemina infection

by Lérias, Joana Ramos Rapaz
Authors: Domingos, Ana Isabel Amaro Gonçalves--orientador | Carvalho, Luís Manuel Madeira de--Co-orientador | Universidade Técnica de Lisboa--Faculdade de Medicina Veterinária Published by : FMV (Lisboa ) Physical details: XIV, 65 p. il. 30 cm Subject(s): Medicina veterinária --Mestrado | Babesia bigemina | Rhipicephalus (Boophilus) annulatus | Calreticulin | Escherichia coli | Immobilized metal ion affinity chromatography | Cromatografia de afinidade por iões metálicos imobilizados Year: 2012
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Tese Tese Faculdade de Medicina Veterinária
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Ana Isabel Amaro Gonçalves Domingos ; Luís Manuel Madeira de Carvalho - Orientadores. Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária. Universidade Técnica de Lisboa. Faculdade de Medicina Veterinária. 2012

Inclui bibliografia (p. 49-63) e índice

Ticks are obligate parasites in a large variety of hosts and are considered to be, after mosquitoes, the second worldwide vector of human and animal diseases. Bovine babesiosis causes substantial economic losses due to animal mortality, abortions and anaemia, among other effects. Calreticulin protein that has been identified in several species including ticks and previous experiments showed that calreticulin gene was up-regulated in R. annulatus ticks infected with B. bigemina and that its knockdown by RNAi technique leads to a reduction of both pathogen transmission and ticks weight. This Master thesis was developed within a project on “Differential expression and functional characterization of tick (Rhipicephalus annulatus) genes in response to pathogen infection (Babesia bigemina)”, financed by the Science and Technology Foundation (FCT), with the project number of PTDC/CVT/112050/2009. The aim of this study was the isolation of calreticulin gene, purification of calreticulin protein and its further use to produce antibodies for the purpose of immunolocalization studies and vaccination tests. In this Master thesis, calreticulin gene was amplified by PCR technique, sequenced and compared with calreticulin from the R. annulatus sequence, showing 98% identity. Afterwards, an Escherichia coli recombinant system was used in order to produce a calreticulin protein. Finally, recombinant proteins were purified using IMAC technique, due to the affinity of expressed calreticulin protein histidine tail to nickel ions. After specific elution and a final sample concentration, a unique protein was achieved in the purified sample, corresponding to recombinant calreticulin. The results of this study were optimistic and represent one more step to improve ticks control, as we showed in this study that CRT can be produced and purified without contaminants, though further vaccination and immunolocalization studies will be the key to understand CRT future use.

Resumo - As carraças são parasitas obrigatórios de uma grande variedade de hospedeiros, sendo consideradas, depois dos mosquitos, os mais importantes vectores de doenças em humanos e animais. A babesiose bovina conduz a elevados prejuízos económicos, devido ao aumento da mortalidade animal, abortos e anemia, entre outros. A calreticulina é uma proteína já identificada em várias espécies, incluindo carraças e estudos anteriores demonstraram que o gene calreticulina estava sobreexpresso em carraças R. annulatus infectadas com B. bigemina e, após o seu silenciamento através da técnica de RNAi, ocorria uma redução tanto na transmissão do agente patogénico, como no peso das carraças. Esta tese de Mestrado foi desenvolvida em paralelo com o projecto “Expressão diferencial e caracterização de genes de carraça (Rhipicephalus annulatus) em resposta à infecção por agente patogénico (Babesia bigemina)”, financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia, sendo o número do projecto PTDC/CVT/112050/2009. A finalidade deste trabalho consistiu no isolamento do gene calreticulina e purificação da correspondente proteína, para posteriormente ser usada na produção de anticorpos destinados a estudos de imunolocalização e de vacinação. Nesta tese de mestrado, amplificou-se o gene da calreticulina pela técnica de PCR, e sequenciou-se esse gene e comparou-se com a sequência da calreticulina da carraça R. annulatus, obtendo-se uma identidade de 98%. Posteriormente, o gene foi expresso em Escherichia coli de modo a produzir-se calreticulina. Finalmente, as proteínas recombinantes foram purificadas através do método IMAC, dado a calreticulina expressa ter uma cauda de histina com afinidade para iões níquel. Após a eluição específica e a concentração das amostras finais, verificou-se que uma única proteína, correspondente à calreticulina recombinante, se encontrava presente na amostra purificada. Os resultados deste estudo foram positivos e representam mais um passo para melhorar o controlo das carraças, uma vez que este estudo demonstrou que a CRT pode ser produzida e purificada sem contaminantes, apesar de estudos posteriores de vacinação e imunolocalização serão essenciais para perceber qual o futuro da CRT.

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